Una máquina PCR
Parece ser que nuestro vocabulario se enriquece, entre otras cosas, a golpe de crisis. Desgraciadamente, en los últimos tiempos hemos tenido que aprender muchas palabrejas nuevas y durante las últimas semanas ha aparecido un acrónimo nuevo, la PCR.
PCR hace referencia a reacción en cadena de la polimerasa, (PCR son las siglas en inglés, Polymerase Chain Reaction). Esta es una técnica empleada masivamente en biología molecular que supuso un punto de inflexión en la investigación relativa al ADN. Cuando la conocí, hace mucho años ya durante mis escarceos con la biología molecular, me sorprendió la simplicidad, la elegancia y la potencia del procedimiento. En esta entrada voy a intentar explicar lo mejor posible en qué consiste esta técnica y su potencia experimental.
¿Qué hace la PCR?
La función no puede ser más simple. La PCR es un mecanismo que multiplica un trozo de ADN muchísimas veces. Es decir, es una operación cíclica que toma un trozo de ADN y en cada paso del ciclo produce una copia, así que en cada paso el número de trozos de ADN se dobla.
No es difícil imaginar que esta técnica permite trabajar con grandes cantidades de ADN — regiones en las que estamos interesados –. Esto es esencial para cosas tales como determinación de la masa del trozo, secuenciación, y manipulaciones varias.
Breve descripción del ADN
El ADN es una molécula maravillosa que es la responsable de contener la información genética de un ser vivo. En esta sección vamos a dar unas pinceladas sobre su estructura.
ADN viene de Ácido DesoxiriboNucleico. Un bonito nombre que puede que nos diga poco, pero en la estructura del ADN podremos distinguir entre dos partes claramente diferenciadas:
1.- Tenemos un armazón exterior formado por unidades de un tipo de azucar denominada pentosa.
2.- Tenemos un interior formado por cuatro moléculas que se denominan bases nitrogenadas. Estas cuatro moléculas se denominan Adenina, Timina, Guanina y Citosina, y se representan por sus iniciales A, T, G, C.
Una descripción molecular, las pentosas son justamente los pentágonos exteriores que conforman el esqueleto del ADN
El caso es que el ADN forma hebras dobles muy largas, es una macromolécula de increíble estabilidad a pesar de su tamaño siempre que se den las condiciones precisas. La posibilidad de formar hebras dobles viene de la mano de que las moléculas A, T, G y C tienen la capacidad de formar entre sí uniones electromagnéticas débiles. Pero no lo hacen indiscriminadamente, una molécula de tipo A solo se une a una de tipo T y viceversa, y una de tipo G se une a una de tipo C. Por lo tanto, conocida la secuencia de una de las hebras podemos deducir la secuencia de la hebra complementaria.
Modelo 3D de una doble hélice de ADN (Wiki)
Estas dos hebras que se entrelazan entre sí para formar la estructura del ADN le dan la típica forma de helice tan conocida de esta molécula.
El ADN y la temperatura
El ADN, como hemos dicho es una estructura ciertamente estable siempre que estemos dentro de unos estrechos márgenes de condiciones concernientes a temperaturas, pH, etc. Un efecto de interés para nosotros ahora es el relativo al comportamiento del ADN con la temperatura.
Resulta que si el ADN se encuentra a altas temperaturas, alrededor de 90º, las dos hebras del ADN se separan, en términos técnicos a este proceso se denomina desnaturalización.
Esto es debido a que las uniones A-T y G-C tienen un carácter electromagnético débil. Son uniones de muy baja intensidad. Por lo tanto, si el medio tiene una alta temperatura inducirá vibraciones y movimientos térmicos en el ADN que serán capaces de romper estas uniones denominadas puentes de hidrógeno.
Mantengamos esto en la cabeza, subiendo la temperatura podemos separar las hebras de la doble hélice del ADN.
¿Cómo se copia el ADN?
En muchos procesos celulares hay que hacer copias del ADN, por ejemplo en la división celular. Existe todo un complejo y maravilloso mecanismo de enzimas y proteínas que se encargan de hacer copias del ADN. Entre todas ellas hay una que brilla con luz propia, la polimerasa.
La polimerasa es una proteína que es capaz de leer hebras individuales del ADN y pegar nucleótidos que hay en el ambiente de forma consistente. Es decir, si se encuentra con una molécula A le pegará una molécula T, si se encuentra con una molécula C le pegará una molécula G y así sucesivamente.
Nota para los especialistas: Soy consciente de que el mecanismo de copiado por la polimerasa es mucho más complejo y fascinante. Pero no quiero entrar aquí en describir completamente el proceso y enfangarme con sentidos de lectura y fragmentos, etc. Disculpen la falta de completitud.
La polimerasa tiene un punto flaco, solo puede leer hebras individuales, así que alguien se tiene que encargar de romper la cadena de ADN en dos partes antes de que la polimerasa pueda empezar su tarea. En las células hay delicados mecanismos enzimáticos que se encargan de ello.
Una imagen de la polimerasa actuando es la siguiente:
Y una animación del proceso:
http://www.reddit.com/r/biologygifs" />Animación tomada de: http://www.reddit.com/r/biologygifs
Si queremos copiar ADN en una máquina, ¿Cómo lo hacemos?
Cuando queremos investigar con ADN es muy conveniente tener grandes cantidades del mismo. Esto supone un problema porque extraer ADN de un bicho vivo es tedioso, costoso y no muy eficiente. Así que sería genial tener un mecanismo “artificial” para poder producir copias de nuestro ADN de interés en cadena.
¿Qué ingredientes necesitamos para copiar ADN?
- Necesitamos la muestra de ADN. Eso es fácil de conseguir.
- Necesitamos un mecanismo para abrir las hebras de ADN. Eso lo podemos hacer subiendo la temperatura.
- Necesitamos nucleótidos — los ladrillos individuales del ADN –. Esto tampoco supone ningún problema, los podemos echar en la cantidad que queramos.
- Necesitamos una polimerasa que se encargue de copiar el ADN. Y aquí surge un problema.
La polimerasa es muy tiquismiquis con las temperaturas. Las polimerasas de los seres vivos dejan de funcionar cuando la temperatura es muy elevada, literalmente se descompone. Sufre un proceso de desnaturalización. La polimerasa es una proteína, es una cadena de aminoácidos que se enrrollan entre sí dando lugar a una estructura tridimensional. La funcionalidad de las enzimas, y de la polimerasa específicamente, depende de esta estructura tridimensional.
Esquematización de la estructura tridimensional de la polimerasa de ADN.
Si subimos la temperatura la enzima comienza a sufrir movimientos térmicos y vibraciones que pueden ser tan grandes como para cambiar su estructura y por lo tanto perder su funcionalidad.
Un ejemplo cotidiano de esto es la reacción que sufre la clara del huevo al freírlo, eso es una desnaturalización de las proteínas allí presentes:
Así que, por un lado tenemos que aumentar mucho la temperatura para abrir el ADN y que la polimerasa pueda copiarlo. Por otro lado, ese aumento de la polimerasa hace que esta pierda su funcionalidad. Parece que estamos en un callejón sin salida. Una metodología basada en aumentos de temperatura parece que no va a tener futuro.
Sorpresas te da la vida
La vida es una cosa maravillosa, y hay seres vivos que nos dieron la solución a este problema. Hay seres vivos que son capaces de desarrollarse y vivir tan ricamente en lugares de altísima temperatura como en fumarolas o en fuentes de alta temperatura cerca del volcanes. Específicamente estamos hablando de unas bacterias que viven en entornos de temperaturas medias de 80º y superiores, las thermus aquaticus.
Estos bichos tienen sus proteínas adaptadas a funcionar en ambientes de muy alta temperatura. Por ejemplo su polimerasa puede funcionar hasta temperaturas de alrededor de 100º. Esto lo consiguen por modificaciones en la composición de las enzimas que le confieren una alta resistencia a las fluctuaciones y movimiento térmicos.
Así que todo lo que hay que hacer es tomar dicha polimerasa y emplearla en un proceso de copiado de ADN basado en la temperatura.
Los pasos de la PCR
Muy brevemente vamos a describir un ciclo PCR:
- Se introduce la muestra de ADN en un ambiente rico en nucleótidos y con polimerasa termoestable.
- Se calienta la mezcla hasta los 90º aproximadamente — un poco más –, para conseguir la desnaturalización del ADN. Este paso es corto, del orden de 30 segundos.
- Se baja la temperatura hasta los 60º aproximadamente y se espera del orden de un minuto. En este paso se inicializa el proceso de copiado por parte de la polimerasa.
- Se sube la temperatura hasta los 75º-85º porque en este rango está es la temperatura de trabajo óptima de la polimerasa empleada. Se puede conseguir un ritmo de copiado de 100 nucleótidos por minuto.
Estos pasos se repiten las veces necesarias y finalmente la muestra se enfría hasta los 15º para asegurar la estabilidad del ADN copiado. En cada paso, en condiones ideales, se ha doblado el número de moléculas de ADN con este simple mecanismo.
Gracias a este procedimiento con una pequeña muestra podemos analizar ADN viral, bacteriano, de escenas de un crímen, para análisis genéticos, para uso experimental, y un largo etc.
Me parece alucinante y bellísimo que podamos hacer esto.
Nos seguimos leyendo…
Archivado en: biología molecular Tagged: ADN, PCR, polimerasa
Fuente
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